Влияние Канглайта на цикл пролиферации опухолевых клеток (Скачать)

Ян Хуа, Ван Сянпин, Юй Линьлинь, Чжен ШуОнкологический институт медицинского университета Чжецзян

Резюме

         Изучали влияние Канглайта для инъекций на цикл пролиферации опухолевых клеток. Исследование показало, что пустая эмульсия оказывает слабый ингибирующий эффект на опухолевые клетки. Степень ингибирования 1:12 разбавленной эмульсии (равной 50 мкл/мл) для клеток КВ – 10 %. IC50 Канглайта была 22,6 мкл/мл для клеток КВ и 38,5 мкл/мл для клеток К562. Методом проточного цитометрического сканирования было обнаружено, что Канглайт подавляет пролиферацию опухолевых клеток, ингибируя клеточный митоз. После обработки Канглайтом опухолевых клеток, число клеток в S-фазе снизилось, а количество клеток в G2+М фазе возросло, полученные результаты зависели от дозы препарата. Способность к пролиферации пораженных опухолевых клеток снизилась, что возможно индуцировало апоптоз опухолевых клеток.
         Канглайт для инъекций производится из активных веществ, экстрагированных с помощью современных технологий из семян Коикс, применяющихся в традиционной китайской медицине. Фармакодинамическими и клиническими исследованиями было доказано определенное ингибирующее влияние и терапевтическое действие Канглайта в форме эмульсии для инъекций на многие опухоли. Эксперименты также показали, что Канглайт может повышать иммунитет у людей. Исследование механизма, лежащего в основе противоопухолевого действия Канглайта, послужит важным руководством для клинического применения. В этом исследовании мы изучали влияние Канглайта на цикл пролиферации опухолевых клеток./p>

Ключевые слова: Канглайт, опухолевые клетки, цикл пролиферации.

1. Материалы и методы

1.1.Препараты и реагенты
        Канглайт для инъекций (10 %) и эмульсия для контроля были предоставлены Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co., Ltd. Голубой тетразолий [3(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н тетразолий бромид] (МТТ), RPMI-1640 и йодистый пропидий (PI) были приобретены в компаниях Merck, Sigma и Gigco соответственно. Митомицин был производства Kyowa.

1.2. Клеточные культуры
      Линия клеток человеческой плоскоклеточной карциномы полости рта была предоставлена институтом биологии в Шанхае, подчиненным Китайской академии наук. Линия клеток человеческой эритролейкемии К562 была получена в институте иммунологии университета Kiel, Германия. Клетки культивировали и пересевали обычным способом в отделе цитологии онкологического института медицинского университета Чжецзяна.

1.3. Инструменты
       Проточный цитометр (FACScan) приобретен в Becton Dickinson, USA. Автоматический энзим меченый фотометр – тип Sigma 960.

1.4. МТТ-метод (восстановление голубого теразолия)
        В каждую лунку 96-луночного плато добавляли 2?105/мл опухолевых клеток в объеме 0,2 мл в логарифмической фазе роста. В контрольной группе в лунки вносили физиологический раствор, в положительном контроле – митомицин С и в экспериментальных группах – различные концентрации Канглайта. Каждая группа состояла из 6 лунок. Клетки культивировали в инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 в течение 72 ч. Раствор МТТ (5 мг/мл) 10 мл добавляли в каждую лунку за 4 ч до окончания эксперимента. После полного растворения кристаллов поглощение в каждой лунке было измерено с помощью фотометрии при длине волны 570 нм. Степень ингибирования клеточной пролиферации рассчитали по формуле:
         Степень ингбирования (%) = (1 – значение O.D. в экспериментальной группе / значение O.D. в контрольной группе) 100 %.
        IC50 рассчитывали с логарифмической вероятностью графическим методом.

1.5. Пролиферацию клеток определяли на проточном цитофотометре
        Собранные клетки фиксировали дегидрированным спиртом, затем обрабатывали РНКазой и окрашивали йодистым пропидием за полчаса до исследования. Использовали проточный цитофлюориметр FACScan для исследования ДНК. Данные обрабатывали на профессиональном оборудовании Multicycle для расчета процентного соотношения клеток в разных фазах.

2. Заключение и обсуждение

2.1. Ингибирующее влияние Канглайта на пролиферацию опухолевых клеток
         Пролиферация КВ и К562 клеток была значительно угнетена после обработки Канглайтом в течение 72 ч. IC50 Канглайта был 22,6 мкл/мл для КВ клеток и 38,5 мкл/мл для К562 клеток. Степень ингибирования 1:20 разведенной контрольной эмульсии (равной 50 мкл/мл) составила 10 % для КВ клеток и IC50 позитивного контроля с митомицином был 0,54 мкл/мл для КВ клеток.

2.2. Влияния Канглайта на цикл пролиферации опухолевых клеток
        В таблице показано, что после обработки 1 мкл/мл Канглайта в течение 48 ч значительно увеличилось процентное соотношение клеток в S фазе и в G2+М фазе. После обработки Канглайтом в концентрации 5 мкл/мл процент К562 клеток в S фазе снизился, а процент клеток в G2+М фазе заметно повысился. После обработки Канглайтом в концентрации 10 мкл/мл клетки К562 в S фазе в экспериментальной группе снизились до 11,6 % к контрольной группе, тогда как клетки в G2+М фазе в экспериментальной группе увеличились в 11 раз по сравнению с контрольной группой. При обработке клеток Канглайтом в концентрации 50 мкл/мл 100 % клеток погибли, и невозможно было анализировать фазы распределения цикла пролиферации клеток. Этот эксперимент показал, что цикл пролиферации К562 клеток заметно зависит от Канглайта и это дозозависимое отношение. Влияние Канглайта на цикл пролиферации опухолевых клеток происходит главным образом из-за задержки клеточного цикла в фазе G2+М, сокращения числа клеток, вступающих в G0 и G1 фазы и снижения процента клеток в S фазе. В результате Канглайт ингибирует митоз и пролиферацию опухолевых клеток и индуцирует апоптоз пораженных клеток.
         Эксперимент в контрольной группе показал, что цикл пролиферации К562 клеток не подвержен влиянию контрольной эмульсии в концентрации ниже 10 мкл/мл (см. рис. 1). Это демонстрирует, что Канглайт может значительно влиять на цикл пролиферации опухолевых клеток. Японские ученые сообщили, что они выделили два компонента с ингибирующим действием на асцитную карциному Эрлиха у мышей из спиртового экстракта семян коикс. Один является причиной поражения цитоплазмы, а другой вызывает остановку ядра в метафазе цикла пролиферации клетки. Это исследование показало, что Канглайт может инигибировать пролиферацию опухолевых клеток, останавливая митоз.

Таблица 1. Влияние Канглайта для инъекций на цикл пролиферации клеток К562

Группы

Концентрация, мкл /мл

G1 %

S %

G2+M %

Контроль

 

42,4

51,6

6,0

Эмульсия

1
5
10

42
45,3
41,0

47,4
52,7
48,3

5,4
2,0
10,6

Канглайт

15
10
50

26,2
27,2
26,4

58,1
25,1
6,1
Смерть клеток

15,7
48,8
67,5

Список литературы
1. Camplin B.G., Pym J., Baker H.M. et al. Chemo-sensitivity Testing of Small Cell Lung Cancer Using MTT Assay. Br. J. Cancer, 1991, 63: 75.
2. Dosik G.M., Barligie B., Smith T.L. et al. Pretreatment Flow Cytimetry of DNA Content Acute Leukemia. Blood. 1980, 55: 74.
3. Li F.Y. et al. Journal Practical Oncology, 1994, (3): 59.
4. Liu J.X., Liao M.L., Yan D.J. Clinical Summary of Kanglaite Injection in Treating Primary Lung Cancer, Newsletter of Anticancer Pharmaceuticals in Zhejiang, 1995, 8