Влияние Канглайта для инъекций на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток(Скачать)

Медицинский университет, онкологический институт, Чжецзян


Ян Хуа, Ван Сянпин, Юй Линьлинь, Чжен Шу

Резюме

        Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – одна из основных причин, приводящих к неблагоприятному исходу химиотерапии рака. Изменяющие МЛУ агенты имеют широкую перспективу в клиническом применении. Это исследование изучает влияние Канглайта для инъекций на МЛУ опухолевых клеток путем рассмотрения чувствительности к Канглайту и некоторым другим химиотерапевтическим агентам устойчивой к лекарствам клеточной линии человеческой эритролейкемии К562/vcr. В исследовании применен ММТ-метод. Используя в качестве контроля агент верапамил, влияющий на МЛУ, изучили действие Канглайта на опухолевые клетки, чувствительные к Доксорубицину. Исследование показало, что чувствительность к Канглайту устойчивой к препаратам клеточной линии К562/vcr ниже, чем чувствительной к препаратам клеточной линии К562/vcr. Стойкая устойчивость составила 3,54. Изучение по изменению МЛУ на К562/vcr клеточной линии показало, что индекс изменения устойчивости при применении верапамила в дозе 6 мкг/мл был 125, а при применении 8 мкл/мл Канглайта – 54,1. Наше исследование подтвердило, что Канглайт эффективно влияет на МЛУ клеток и повышает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам.
Ключевые слова: Канглайт, множественная лекарственная устойчивость.
         МЛУ – одна из основных причин, приводящих к неблагоприятному исходу химиотерапии рака. Развитие МЛУ связано с высокой экспрессией Р-глиопротеина (Р-гп) на поверхности мембраны опухолевой клетки. Р-гп может вытеснять из клеток препарат, уже поступивший в них. В результате дозировка препарата снаружи клеток повышается и развивается МЛУ. Влияющие на МЛУ агенты угнетают Р-гп и возвращают чувствительность подверженным МЛУ опухолевым клеткам к химиотерапевтическим агентам. Для клинического применения влияющих на МЛУ агентов существует широкая перспектива. Многие исследователи отмечают, что верапамил при использовании совместно с химиотерапевтическими агентами очень эффективно влияет на МЛУ. Однако, клиническое применение верапамила сильно ограничено из-за его токсичности. Влияние верапамила на МЛУ дозозависимо. Максимальная переносимая доза верапамила в клиническом применении – 2 ммоль/л, но концентрация верапамила для достижения влияющего на МЛУ эффекта – 3-6 ммоль/л. Поэтому ученые ищут другие воздействующие на МЛУ агенты с высокой эффективностью и низкой токсичностью. Многие фармакологические и клинические исследования показывают, что Канглайт при комбинированном применении с химиотерапией и радиотерапией может создавать синергическое действие, повышать терапевтический эффект и предотвращать или снижать химиотерапевтическую и радиотерапевтическую токсичность. Механизм данного действия оставался неопределенным. Это исследование изучило влияние Канглайта для инъекций на МЛУ опухолевых клеток.

  1. Материалы и методы
    1. 1.Клеточные культуры и клеточные линии с МЛУ

        Клеточная линия К562 человеческой эритролейкемии была предоставлена институтом инммунологии, Kiel University, Germany. МЛУ К562/vcr клеточная линия была создана доктором Ху Сюнь в онкологическом институте медицинского университета Чжецзян. Клетки культивировали и пересевали в отделе цитологии этого института.

    1. 2.Препараты и реагенты

          Канглайт для инъекций (10 %) был представлен Zhejiang Kanglaite Pharmaceytical Co.,Ltd. Доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, харрингронин, митомицин С, верапамил, метотрексат, [3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2Н-тетразолин-бромид] (МТТ) были приобретены в компаниях Toubin, Farmitalia Carlo Erba Minsheng Kyowa и Serva, соответственно.

    1. 3.Инструменты

                СО2 клеточный инкубатор WJ-RF, инвертируемый микроскоп Olympus, фотометр, Сигма 960.

    1. 4.Эксперимент с лекарственно-устойчивыми клетками и модифицирующий МЛУ тест (МТТ-тест)

             Опухолевые клетки в логарифмической фазе роста в концентрации 2?104/мл внесены в каждую лунку 96-луночного культурального плато. Затем добавлялись противоопухолевые агенты разной концентрации и клетки культивировали 72 ч. В каждую лунку добавляли 50 мл МТТ (1 мг/мл). Клетки инкубировали при температуре 37 С 4 ч. Клеточную суспензию центрифугировали при 2,000 rpm в течение 10 минут. Отбрасывали надосадочную жидкость. Затем в каждую лунку добавляли 100 мл подкисленного изопропанола. После полного растворения кристаллов проводили колориметрию при длине волны 570 нм и рассчитывали 50% ингибирующую концентрацию (IC50). IC50 для лекарственно-устойчивой клеточной линии рассчитывали с помощью формулы:

                ФУ = IC50 У / IC50 Ч,

               Где ФУ – фактор устойчивости,

              У – лекарственно-устойчивая клеточная линия,

               Ч – лекарственно-чувствительная клеточная линия.

            Этот метод также был применен для исследования конверсии МЛУ. Модифицирующие МЛУ агенты и доксорубицин одновременно добавляли в лунки к лекарственно-устойчивой клеточной линии. Индекс изменения устойчивости (RMI) рассчитывали по формуле:

            RMI= IC50 Доксорубицин / IC50 Доксорубицин + МЛУ-модифицирующие агенты.

  1. Результаты

    2.1.Чувствительность к лекарствам клеток К562 и К562/vcr

            Таблица 1 показывает, что К562/vcr клетки были устойчивы и к фитофармацевтикам (винкристин, харрингронин) и к антрациклинам (доксорубицин, эпирубицин) и к антибиотикам (митомицин С). К562/vcr клетки были также незначительно устойчивы к Канглайту.

Таблица 1. Чувствительность клеток К562 и К562/vcr к противоопухолевым агентам

Агент

IC50, мкг/мл

ФУ

К562

К562/vcr

Доксорубицин

0,9

30

33,3

Эпирубицин

0,8

20

25

Даунорубицин

0,6

2,5

4,2

Винкристин

?0,0012

4

3333

Харрингронин

0,064

20

31

Митомицин С

4

18

4,5

Метотрексат

20

20

1

Канглайт

38,5 мкл/мл

136,4мкл/мл

3,54

    2.2.Влияние Канглайта на МЛУ

Таблица 2 показывает, что верапамил влияет на МЛУ К562/vcr клеток. Верапамил в пределах эффективных концентраций 1,5-6 мкг/мл оказывает сильное воздействие на МЛУ.

Таблица 2. Влияние верапамила на МЛУ клеток К562/vcr

Доксорубицин, мг/мл

Верапамил, мкг/мл

6

3

1,5

0

0,817

0,808

0,802

0,01

0,809

0,889

0,703

0,1

0,458

0,512

0,638

1

0,146

0,181

0,1

10

0,147

0,189

0,190

Доксорубицин+Верапамил

IC50*

0,24

0,285

0,546

RMI

125

105,3

5

*IC50 доксорубицина для К562/vcr – 30 мкг/мл.

Из таблицы 3, отражающей влияние Канглайта на МЛУ клеток К562/vcr, видно, что концентрация Канглайта 2-8 мкл/мл оказывает воздействие на МЛУ.

Таблица 3. Влияние Канглайта на МЛУ клеток К562/vcr

Доксорубицин, мг/мл

Канглайт, мкг/мл

6

3

1,5

0

0,846

0,765

0,805

0,01

0,692

0,718

0,782

0,1

0,686

0,701

0,804

1

0,166

0,192

0,207

10

0,086

0,141

0,174

Доксорубицин+Канглайт

IC50*

0,555

0,664

0,705

RMI

54,1

45,2

42,6

  1. Обсуждение

           Лекарственная устойчивость опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам – большое препятствие в лечении рака. Хотя вначале химиотерапия во многих случаях эффективна, довольно сложно избежать рецидива заболевания из-за развития МЛУ. Лекарственная устойчивость может развиться ко многим химиотерапевтическим агентам, включая алкилирующие агенты, растительные алкалоиды, антибиотики и гормональные агенты. Многие из этих лекарств состоят из липофильных макромолекул. Если наступает лекарственная устойчивость опухолевых клеток к одному из перечисленных агентов, обычно через некоторое время появляется перекрестная устойчивость ко всем другим агентам.

        
            При применении Канглайта у пациентов с МЛУ необходимо увеличить дозировку препарата. Это исследование показывает, что очень маленькая эффективная доза Канглайта (2-8 мкл/мл), которая ниже его IC50 для К562/vcr клеток, заметно воздействует на МЛУ опухолевых клеток к химическим агентам. Это может объяснить механизм действия Канглайта на увеличение чувствительности и эффективности противоопухолевой терапии при комбинировании с химиотерапевтическими агентами. Это исследование подтверждает, что Канглайт следует комбинировать с химиотерапией при лечении опухолей у пациентов с МЛУ для того, чтобы восстановить и увеличить чувствительность опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам.

Список литературы

  1. Fox NE & Rees JK, Chemosensitivity Testing of Fresh Leukemia Cells Using the MTT Colorimetric Assay (1989) Br. J. Haematol 71; 19-22
  2. Hotz MA, Gong J, Traganos F & Darzynkiewicz Z, Flow Cytometric Detection of Apoptosis-Comparison of the Assays of In Situ DNA Degradation and Chromatin Changes. (1994) Cytometry 5; 237-241.
  3. Zhang Wanlin, Wang Huaqin, Li Iiqin, Phase II Clinical Reports of Elemene Injection in Treatment of Malignant Pleurorrhea. (1996) Chinese Journal of Clinical Oncology 23: 75-77.
  4. Xiao Lishen, Zhu Weiming, Clinical Study on the Treatment of Primary Liver Cancer with Elemene Injection (1996) Chinese Journal of Clinical Oncology 23: 757-759.
  5. Yang Hua, Wang Xianping, Yu Linlin, Zheng Shu, The Anti-tumor Activity of Elemene Associated with Apoptosis (1996) Chinese Journal of Oncology 18: 169-172.