Влияние Канглайта для инъекций на ангиогенез (Скачать)

Цзян СяоЛин, Чзан Лян, Сюй Чжоюй, Го Чэнхао

Отделение патологии, Медицинский колледж университета Цин Дао

Резюме

Это исследование было проведено с целью оценки влияния Канглайта для инъекций на ангиогенез.

Метод: Кольца аорты крыс выращивали в коллагеновом геле в смеси 1:1 со средой DMEM/YFV F12 в свободной от сыворотки среде в течение 28 дней. 24 культуральных флакона были разделены на 3 группы: А – контрольная группа; группа В получала витамин Е в дозе 0,1 мг/мл и группа С – Канглайт в дозе 10 мкл/мл. Ежедневно подсчитывали количество вновь сформированных микрососудов с помощью инвертированного микроскопа и составлялись графики микрососудистого роста.
Результат:
Канглайт в дозе 10 мкл/мл и витамин Е в дозе 0,1 мг/мл значительно ингибировали ангиогенез (р?0,01). Ингибирующее действие Канглайта в дозе 10 мкл/мл было более интенсивным, чем в группе, получавшей витамин Е в дозе 0,1 мг/мл (р?0,01).
Заключение:
Канглайт значительно ингибирует ангиогенез, что является важной составляющей механизма его противоопухолевого действия.
Ключевые слова: Канглайт, ангиогенез, витамин Е.

Злокачественные опухоли – одна из основных болезней, серьезно угрожающих здоровью человека. Эффективному предотвращению и лечению рака уделяется много внимания. Противоопухолевые исследования частично переместились от убийства опухолевых клеток (химиотерапии) к ингибированию ангиогенеза. Были выделены и очищены несколько ингибиторов ангиогенеза, но эти субстанции в клинике не применялись. Противоопухолевый препарат Канглайт усиливает иммунные функции и контролирует рост опухоли. Однако связь между противоопухолевым действием и ангиогенезом оставалось неясной. Для получения экспериментальной основы клинического применения Канглайта, было исследовано его влияние на ангиогенез. В качестве модели использовали крысиные аорты, растущие в бессывороточной среде.

1. Материалы и методы
1.1. Реактивы
Канглайт для инъекций был предоставлен фармацевтической компанией Канглайт Чжецзян (Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co., Ltd. Lot No. 9808191-2). DMEM среда и питательная смесь HAMF-12 – продукция GIBCO, витамин Е был приобретен у Shanghai Second Reagent Factory (КНР).
1.2. Тканевые культуры
Торакальные и абдоминальные аорты получены от 2-3-недельных самцов крыс и порезаны на кольца толщиной 1 мм. Для очистки каллогенного раствора использовали препарат модификации Elsdale и Bard. На дно агарозной лунки (внутренний и наружный диаметр 10 и 17 мм соответственно) добавляли 4 капли коллагеновой смеси, после формирования коллоида добавляли коллагеновую смесь до заполнения лунки и затем туда помещали кольца аорты. После полной конденсации в культуральную среду добавляли тестируемые препараты, 200 мг/мл гентамицина и инкубировали при 35,5 ?С. Культуральная среда менялась через день.
1.3. Группы
А группа – контрольная;
В группа – получала 0,1 мг/мл витамина Е;
С группа – получала 10 мкл/мл канглайта.
1.4. Количественный анализ новообразованных кровеносных сосудов
Количество новообразованных микрососудов подсчитывали ежедневно и рисовали кривые роста микрососудов в зависимости от их числа. По нарисованным на бумаге контурам колец аорты можно было отличить различные культивируемые субстанции в одинаковых культуральных флаконах. Подсчитанная норма микрососудов при использовании инвертируемого микроскопа была следующей:
1) Отличие от фибробластов по специальной морфологии зачатков микрососудов (более тонкая, такая же связанная и стойкая структура роста).
2) Один зачаток кровеносного сосуда содержал две ветки, от которых происходили два новых зачатка, которые считали как два.
3) Каждый край кровеносного сосуда был подсчитан как два зачатка, потому что они соединялись двумя полимеризованными микрососудами.
Статистические различия разных экспериментальных групп проводили SPSS аналитическим обеспечением и по критериям Стъюдент-Ньюман-Кейлс.

2. Результаты
2.1. Характеристики роста кровеносных сосудов
Были описаны следующие характеристики роста кровеносных сосудов, культивированных в среде DMEM/HAMF12. Фаза задержки ? фаза роста ? фаза разрушения. Твердые эндотелиальные зачатки кровеносных сосудов росли или из терминальных концов среза или из латеральной части после инокуляции в течение 48 ч. Затем они начинали быстро расти к концу первой недели и быстро разрушались к третьей неделе (рис. 1).

День

1

2

3

4

5

6

7

Число

0

0

0,63±0.74

2,13±0.47

2,63±0.85

3,13±0.17

3±0.85

День

8

9

10

11

12

13

14

Число

2,63±0.60

3,13±0.00

1,75±0.16

2,88±0.75

4,5±0.24

6,5±0.37

9,63±0.41

День

15

16

17

18

19

20

21

Число

9,38±0.00

9,5±0.90

9,25±?0.63

7,38±0.70

7,63±0.93

9,25±0.14

8,5±0.40

День

22

23

24

25

26

27

28

Число

7,25±0.40

6,25±0.80

5±0.82

5,13±0.60

4,63±?0.70

4,25±?0.11

4,13±0.40

Рис. 1. Кривая роста кровеносных сосудов в группе А (контрольной)

2.2. Влияние витамина Е на ангиогенез

Рис. 2 показывает кривую роста кольца аорты под влиянием витамина Е. При окончании фазы роста, число новообразованных кровеносных сосудов было меньше, чем тогда же в контрольной группе, и кривая роста была ниже. Результаты этих двух групп показывают значимые различия (р?0,01) (см. рис. 2).

День

1

2

3

4

5

6

7

Число

0

0

0,63±0.52

1,38±0.06

2,25±0.16

2,5±0.76

3,5±0.69

День

8

9

10

11

12

13

14

Число

2,63±0.60

2,38±0.30

2,75±0.91

2±0.41

2,38±0.19

3,63±0.85

5±0.33

День

15

16

17

18

19

20

21

Число

4,63±0.56

5,88±0.53

7,25±0.76

5,5±0.67

5,25±0.82

5,25±0.05

4,13±0.03

День

22

23

24

25

26

27

28

Число

4,25±0.83

4,13±0.30

3,63±0.41

3,13±0.73

3,13±0.73

2,38±0.06

2,38±0.06

Рис. 2. Кривая роста кровеносных сосудов в группе В (0,1 мг/мл витамина Е)

2.3. Влияние Канглайта на ангиогенез
Кольца аорты, обработанные Канглайтом, редко давали рост новых кровеносных сосудов и вступали в фазу разрушения к концу первой недели. Кривая роста стала низкой и плоской, что показывает способность Канглайта значительно ингибировать ангиогенез. Сравнение с группами А и В показывает значительную разницу: С против А: р?0,01, С против В р?0,01.(см. рис. 3).

День

1

2

3

4

5

6

7

Число

0

0,43±0.53

0,43±0.53

0,86±0.10

0,86±0.10

0,86±0.10

0,71±0.11

День

8

9

10

11

12

13

14

Число

0,29±0.49

0,43±0.79

0,29±0.76

0,29±0.76

0,29±0.76

0,29±0.76

0,29±0.76

День

15

16

17

18

19

20

21

Число

0,29±0.76

0,29±0.76

0,29±0.49

0,29±0.49

0,14±0.38

0,14±0.38

0

День

22

23

24

25

26

27

28

Число

0

0

0

0

0

0

0

Рис. 3. Влияние 10 мкл/мл Канглайта (группа С) на ангиогенез

Среднее суточное число новообразованных кровеносных сосудов в трех группах (А, В и С) показано на рис. 4.

Рис. 4. Среднее суточное число новообразованных кровеносных сосудов в 3 группах

3. Обсуждение

В нашем исследовании по ингибированию ангиогенеза крысиная аорта инкубировалась в трехмерном коллагеновом геле в бессывороточной среде, которая не ограничивает, не инактивирует и не стимулирует тестируемый субстрат. Более того, этот метод высокочувствительный и достоверный. Он является одним из передовых методов в изучении ангиогенеза. В дополнении к интактной контрольной группе, группа, получавшая 0,1 мг/мл витамина Е (позитивная группа), была также представлена для сравнения с ингибирующим влиянием Канглайта на ангиогенез в качестве другого ингибитора ангиогенеза. В 1994 г. Kelloff и соавторы предположили, что витамин Е ингибирует активность ангиогенеза, очищая от свободных кислородных радикалов и восстанавливая функцию иммунитета для антипролиферативной активности, поэтому витамин Е обладает функцией химиопрофилактики рака. Эксперименты на животных, проведенные Shklar и Schwartz в 1996 г., по использованию витамина Е для лечения опухолей животных, вызванных DMBA, показали, что объем опухоли в группе, получавшей витамин Е, был гораздо меньше, чем в контрольной группе, а эндотелиальные клетки кровеносных сосудов и экспрессия TGF-? ингибировались. Это доказывает, что существует связь между опухолью, ангиогенезом и витамином Е. Наши предыдущие эксперименты также показали, что витамин Е в концентрации 0,2 или 0,1 мг/мл может ингибировать ангиогенез, и количество новообразованных кровеносных сосудов было даже меньше, чем в последней группе. Поэтому мы выбрали 0,1 мг/мл витамина Е в качестве позитивной контрольной группы.

В этом эксперименте после воздействия на кольца аорты 10 мкл/мл Канглайта (сильнейшая противоопухолевая концентрация) образовалось несколько кровеносных сосудов, и они вошли в фазу разрушения намного быстрее (см. рис. 3). Следовательно, ингибирующий эффект Канглайта был значительным и гораздо лучше, чем в группе, получавшей 0,1 мг/мл витамина Е (р?0,01). Это доказывает, что один из путей противоопухолевого действия Канглайта осуществляется через ингибирование ангиогенеза, но этот механизм противоопухолевого действия был неясен.

Канглайт для инъекций – препарат в виде эмульсии, экстрагирован из семян традиционного в китайской медицине растения Коикс с помощью современных научных методов. Ему был присужден II Класс Новых Национальных Препаратов. Канглайт – двухфункциональный антинеопластический агент широкого спектра действия, который может убивать опухолевые клетки, поддерживать иммунную функцию, снабжать пациентов энергией, минимизировать токсические и побочные эффекты химиотерапии и улучшать качество жизни больных. Это первое исследование по изучению влияния Канглайта на ангиогенез, и результаты показали, что ингибирование неоваскуляризации играет другую роль в его противоопухолевом действии. Возможный механизм ингибирования Канглайтом ангиогенеза: 1) ингибирование митоза и миграции сосудистых эндотелиальных клеток. Результаты, полученные в исследовании хода клеточного цикла, показали, что Канглайт может задерживать опухолевые клетки в фазе G2+M и уменьшать пропорцию клеток в фазе синтеза ДНК (S фазе); 2) ингибирование опухолевых клеток освобождением надрегуляторных факторов ангиогенеза; 3) блокирование надрегуляторых факторов ангиогенеза или их рецепторов формированием образца антитела; 4) препятствуя дифференциации эндотелиальных клеток в законченные капилляры и предотвращая анастомозирование новообразованных кровеносных сосудов с сосудами организма хозяина. Необходимо дальнейшее исследование для подтверждения того, каким из этих путей Канглайт может ингибировать ангиогенез и вызывать противоопухолевое действие.

Ангиогенез – комплексный биологический процесс. Новообразованные сосуды генерируются из существующих кровеносных сосудов. В основном они растут из первоначальных сосудистых эндотелиальных клеток почкованием и на них влияют растворимые факторы, эндотелиальные клетки и другие внеклеточные вещества. Рост и метастазирование раковых клеток находится в соотношении с ангиогенезом. Ранее, в 1863 г. Вирхов отметил, что число кровеносных сосудов в злокачественной опухоли резко возрастает. Концепция неоваскуляризации была представлена Algre в 1945 г. Когда формируется солидная опухоль, она задерживается в преваскулярной фазе, и опухолевые клетки выживают главным образом за счет питания путем диффузии. Диаметр опухолевой массы меньше чем 2-3 мм, и число клеток обычно меньше чем 107. После этого, если в опухолевой массе еще недостаточно новых капилляров и маленьких кровеносных сосудов для обеспечения питания, ее рост будет задержан, клетки погибнут и опухолевая ткань дегенерирует. Если новообразованные капилляры инфильтрируют опухолевую ткань, которая начнет расти быстро, скорость роста кровеносных сосудов в 50-100 раз выше, чем нормальных тканей и легче приводит к инфильтрации и метастазированию рака. Таким образом, неоваскуляризация – одно из важных условий пролиферации опухоли и метастазирования. Этот процесс дает возможность эффективного подхода к лечению рака путем ингибирования ангиогенеза. Уделяется много внимания использованию опухолевых сосудов в качестве мишени для проведения противоопухолевой терапии, рекомендованному Folkman в 1971 г. Такое же исследование было проведено в США в клинических испытаниях в 1998 г.

В заключение, Канглайт не только контролирует опухолевый рост и метастазирование, поддерживает иммунную функцию, дает высокоэнергетическое питание, контролирует течение рака, но также значительно ингибирует ангиогенез, что может усиливать вышеперечисленные способности, без очевидных токсичных или побочных эффектов. Подтверждено, что Канглайт является идеальным терапевтическим препаратом среди антинеопластических агентов, применяемых сегодня, и очень важно способствовать его клиническому применению.

Список литературы

  • Elsdale T., Bard J. Collagen Substrate for Studies on Cell Behavior. J. Cell Biol., 1972; 54: 626-637.
  • Shklar G., Schwartz JL. Vitamin E Inhibits Experimental Carcingenesis and Tumor Angiogenesis. Eur. J. Cancer B. Oral. Oncol., 1996; 32Bi(2):114-119.
  • Wang Junjie, Sun Xinchen, Shen WenJiang et al. Induction of the Appoptosis of Renal Carcinoma Cells and Regulation of the Expression of FAS/APO-1 and BCL-2 Genes by Kanglaite Injection, China Tumor in Clinic, 1999; 6: 439-442.
  • Ran Jianghua, Zhang Jiahua, Wang Xi et al. Affection of Kanglaite on Immune Function of Large Intestine Patients after Surgical Operation, China Clinic Tumor & Rehabilitation, 1999; 2: 20-21.
  • Folkman J. What Is the Evidence that Tumors Are Angiogenesis Dependent? J Natl Cancer Inst, 1990; 82: 4-6.
  • Folkman J. Anti-angiogenesis: New Concept for Therapy of Solid Tumors. Ann Surg., 1971; 175: 409-416.