Изучение влияния Канглайта для инъекций на клетки лейкемии человека методами
TUNEL и связыванием с меченым аннексином V сканирующей проточной цитометрией
(Скачать)

Ян Хуа, Юй Линьлинь, Ван Вянпин, Чжен Шу
Онкологический институт медицинского университета, Чжецзян

Резюме

Цель: Изучить механизм, лежащий в основе прямого цитотоксического влияния Канглайта для инъекций на опухолевые клетки и его роль в химиотерапии.
Метод:
Наблюдение за апоптозом клеток опухолей человека, вызванным Канглайтом, проводили методом TUNEL и по связыванию с меченым аннексином V
Результаты:
Канглайт оказывает очевидное ингибирующее пролиферацию действие на клетки эритролейкемии человека и клетки солидных опухолей. С помощью метода TUNEL и по связыванию с меченым аннексином V наблюдали апоптоз и некроз с повреждением клеточной мембраны клеток рака толстой кишки SW1116 и клеток эритролейкемии К562, индуцированные 10 мкл/мл Канглайта.
Заключение: ключевой механизм противоопухолевых эффектов Канглайта может быть вызван индуцированным им апоптозом и некрозом опухолевых клеток.

            Канцерогенез связан с неконтролируемой пролиферацией и блокированием апоптоза опухолевых клеток. Апоптоз опухолевых клеток – горячая тема в онкологических исследованиях и измерение индуцированного апоптоза опухолевых клеток возникает как новая модель в лечении злокачественных опухолей. Недавно китайские ученые отметили, что лечение острого промиелоцитарного лейкоза соединением мышьяка (Se2O3) приносит удовлетворительные результаты. Они продемонстрировали, что Se2O3 индуцирует апоптоз клеток премиелоцитарной лейкемии и создает успешную модель для терапии, индуцирующей апоптоз. Фармакологические исследования Кангайта in vivo и in vitro показали его цитотоксические эффекты для многих опухолевых клеток. Недавние исследования показали, что Канглайт ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, благодаря влиянию на замедление G2/М фазы, снижение количества клеток в S фазе и сокращение митоза опухолевых клеток. Но до сих пор еще не было ничего сообщено о том, что Канглайт индуцирует апоптоз опухолевых клеток. В этом исследовании проведены наблюдения, чтобы доказать in vitro апоптоз опухолевых клеток человека, индуцированный Канглайтом, для попытки создания теоретической основы для клинического применения Канглайта в лечении рака.

1. Материалы и методы

1.1. Клеточные культуры и препараты
          Опухолевые клетки, включая клетки человеческого рака желудка MNK28, клетки человеческого рака толстой кишки SW1116, COLO 205 и WiDr, клетки человеческого рака печени 7901, клетки эритролейкемии человека К562 и клетки плоскоклеточной карциномы человека КВ, культивировали и пересевали в среде RPMI-1640 с 10% телячьей сывороткой (Gibco, USA) в нашей лаборатории. Канглайт (10%) и эмульсия были предоставлены Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co., Ltd. Голубой тетразолий [3(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н тетразолий бромид, МТТ], реагенты для метода TUNEL и меченый аннексин V приобретены в Sigma и Boehringer Mannheim соответственно.

1.2. Инструменты
         Проточный цитометр (FAC Scan) приобретен в Becton Dickinson. Автоматический ферментно меченый фотомер (Sigma 960) приобретен в Sigma, USA

1.3. МТТ-метод
        Опухолевые клетки в логарифмической фазе роста 1?105/мл внесли в каждую лунку 96-луночного плато. Были созданы группа с физиологическим раствором (лунка) и экспериментальные группы (лунки) с разными концентрациями Канглайта. Для каждой лунки был дубликат. Клетки культивировали в инкубаторе при 37С, 5% СО2 в течение 72 ч. МТТ (5мг/мл) 10 мкл добавляли в каждую лунку за 4 ч до окончания эксперимента. После полного растворения кристаллов, измеряли поглощение в каждой лунке с помощью фотометрии при длине волны 570 нм и рассчитывали для каждого препарата 50% ингибирующую концентрацию (IC50).

1.4. Исследование клеточного апоптоза с помощью метода TUNEL
         In situ использовали детектор клеточной смерти Kits. 1?105/мл клеток дважды промыли фосфатным буерным раствором (PBS). Для фиксации добавили 4 % параформальдегид на 30 минут. Суспензию центрифугировали при 2,000 rpm в течение 10 минут. Отбрасывали надосадочную жидкость. Клеточный осадок снова промывали PBS и добавляли 0,1% Тритон-100. Клетки охлаждали на льду в течение 2 минут и промывали еще раз PBS. К клеточному осадку добавили 50 мкл меченой TUNEL смеси (содержащей терминальную деоксинуклеотидил трансферазу). Клетки держали при 37 ?С в течение 1 ч, дважды промывали PBS и еще добавляли 500 мкл PBS. Клеточная суспензия была готова к исследованию.

1.5. Исследование клеточного апоптоза методом мечения аннексином V
         Для метки был использован жидкий аннексин V. 1?105/мл клеток дважды промывали раствором Хэнка. Добавляли 100 мкл меченого буферного раствора, содержащего жидкий аннексин V 20 мкл и йодистый пропидий (PI) 20 мкл (50мкл/мл). Суспензию держали при комнатной температуре в течение 15 минут для исследования.

2. Результаты

2.1. Ингибирование Канглайтом опухолевых клеток
          Ингибирующее действие на клетки человеческой эритролейкемии и клетки солидных опухолей наблюдали после обработки Канглайтом в течение 72 ч. Чувствительность IC50 опухолевых клеток к Канглайту, обнаруженная в этом исследовании, была 38,5 мкл/мл для клеток К562, 22,6 мкл/мл для клеток КВ, 45,1мкл/мл для клеток SW1116, 85,9 мкл/мл для клеток WiDr, 21,4 мкл/мл для клеток MKN28 и 185 мкл/мл для клеток 7901. Клетки Colo205 относительно нечувствительны к Канглайту, IC50400мкл/мл.

2.2. Метод TUNEL для исследования индуцирования Канглайтом апоптоза опухолевых клеток

              Рис. 1 показывает, что апоптоз клеток рака толстой кишки человека SW 1116 после обработки Канглайтом в течение 24 ч исследовался методом TUNEL. Для клеток, обработанных 10 мкл/мл Канглайта степень позитивных клеток в участке М2 была 15,68 %, а для контрольной группы, обработанной физиологическим раствором – 4,5 %. При обработке клеток 50 мкл/мл и 100 мкл/мл Канглайта соответственно не наблюдали значительного процентного соотношения позитивных клеток в участке М2 между группами, обработанными Канглайтом, и контрольной группой, обработанной физраствором, что показывает способность Канглайта в концентрации 10 мкл/мл индуцировать апоптоз клеток SW 1116.

2.3. Метод мечения аннексином V для исследования Канглайт-индуцированного апоптоза опухолевых клеток

           Рис. 2 показывает исследование методом мечения аннексином V апоптоза и некроза клеток человеческой эритролейкемии К562, обработанных Канглайтом в течение 6 ч. Участок М2 FL1-H показывает меченные аннексином V позитивные клетки. Всего несколько позитивных клеток было найдено в группе физиологического раствора и группе эмульсии (10мкл/мл), тогда как позитивные клетки в группе Канглайта (10мкл/мл) почти всегда дублировались. Процент позитивных клеток сократился при обработке клеток Канглайтом в концентрации 50 мкл/мл и 100 мкл/мл. Участок М3 FL2-H показал сильно окрашенную йодистым пропидием подгруппу, подтверждая, что проницаемость клеточной мембраны значительно возросла. Процент МЗ позитивных клеток в группе, обработанной физиологическим раствором и в группе эмульсии был очень близок, но в группе, обработанной Канглайтом (10 мкл/мл) он дублировался. При обработке клеток 50 мкл/мл Канглайта процент позитивных клеток был 40,7 %, превышая почти в 4 раза группу физиологического раствора. При обработке клеток 100 мкл/мл Канглайта степень М3 позитивных клеток была 28 % – почти в 3 раза выше, чем в контрольной группе.
3. Обсуждение
        Апоптоз и некроз – два разных типа клеточной гибели. Некроз – это пассивное завершение жизненной активности клеток в результате уничтожения биомембраны и энергетического метаболизма клетки наружными повреждающими факторам. Апоптоз – активный процесс запрограммированной смерти или самоуничтожения клеток. При апоптозе нуклеосомная цепь ДНК разрывается активированной эндонуклеазой и распадается на 200 bp семгенты с характерным лестничным проявлением в электрофоретическом паттерне. Апоптоз можно также исследовать методом TUNEL. Фосфатидил серин (PS) нормальных клеток распределяется снаружи клеточной мембраны, но вставляется внутрь клеточной ме6мбраны во время апоптоза. В присутствии Ca++, PS может специфически комбинироваться с аннексином V. Следовательно, апоптоз может быть зондирован аннексином V. Живые клетки устойчивы к окрашиванию йодистым пропидием. Сильно окрашенные йодистым пропидием клетки показывают, что проницаемость клеточной мембраны значительно повышена. При совместном использовании в исследовании аннексина V и йодистого пропидия гипохроматия клеток показывает раннюю стадию апоптоза, а гиперхроматическое окрашивание йодистым пропидем показывает клеточный некроз или позднюю стадию апоптоза.
         Основные исследования Канглайта обнаружили, что замедление клеточного деления в фазе G2/М и снижение ДНК-синтетазы (S-фазы) Канглайтом является базовым механизмом его противоопухолевого действия. Замедление деления клеток в фазе G2/М было важной предрасполагающей причиной для индуцирования апоптоза многими противоопухолевыми химическими веществами, когда они активировали апоптотические факторы в опухолевых клетках. Мы обнаружили, что апоптоз может быть индуцирован в К562-клетках после их обработки 10 мкл/мл Канглайта в течение 6 ч и что повреждение мембраны опухолевой клетки и некроз опухолевых клеток, заметный по сильному окрашиванию йодистым пропидием, происходят при увеличении концентраций Канглайта. Апоптоз клеток SW1116 также наблюдали методом TUNEL после обработки клеток мкл/мл Канглайта. Но процент меченых TUNEL позитивных клеток сократился с увеличением концентраций Канглайта вероятно из-за усиления клеточного некроза. В этом исследовании очевидные изменения микроструктуры опухолевых клеток также наблюдали после обработки клеток Канглайтом, включая широкий распад вакуолей, конденсацию хроматрина и апоптотических гранул, которые являлись морфологическими характеристиками клеточного апоптоза (см. рис. 3).
4. Заключение
       
В нашем эксперименте большая часть опухолевых клеток была чувствительна к Канглайту с небольшими исключениями, такими как клеточная линия Colo205. Индуцированные Канглайтом апоптоз и некроз опухолевых клеток человека являлись ключевым механизмом для его цитотоксического действия в лечении опухолей и это действие имеет дозозависимое отношение.

Список литературы

1. Sen S.D., Incalci M, FEBS, 1992, 307: 122.
2. Gorezgea W. Bigmind, Mittleman A. et al. Leukemia, 1993, 7: 659.
3. Gorezgea W. Gong J., Darzynkiewica Z. Cancer Res, 1993, 53: 1945.
4. Vermes J et al. J Immunol. Methods 1995, 184: 39.
5. Koopman G. et al. Blood, 1994, 84: 1415.
6. Yang H, Wang XP, Yu LL et al. The Effects of Kanglaite Injection on Cancer Cell Proloferation Cycle

Рис. 1. Апоптоз клеток человеческого рака толстой кишки SW 1116, индуцированный 24-ч воздействием Канглайта, исследованный методом TUNEL

А – контроль (физиологический раствор); Б – 10 мкл/мл Канглайта; В – 50 мкл/мл Канглайта; Г – 100 мкл/мл Канглайта