Изучение апоптоза клеток рака почки и экспрессии генов Fas/Apo-1 и Bcl-2, индуцированных Канглайтом для инъекций (Скачать)

Ван ЦзюньЦзе*, Сунь Синьчэнь*, Шень Вэньцзян*, Юй Личзан**, Юй Шипин*
*Центр лечения рака, первый госпиталь медицинского университета Пекина
**Институт урологии, первый госпиталь медицинского университета Пекина
Резюме

Цель: Изучить механизм противоопухолевого действия Канглайта для инъекций. Материалы и методы:
           Ингибирующее действие Канглайта на клетки рака почки исследовали МТТ-методом. Клеточный апоптоз анализировали методом TUNEL. Экспрессию генов Fas/Apo-1 и Bcl-2 изучали иммуногистохимическим методом.
Результаты:
           IC50 Канглайта для ингибирования клеток рака почки – 19,31 мкл/мл. Канглайт в концентрациях 5 мкл/мл и 10 мкл/мл может эффективно индуцировать апоптоз опухолевых клеток с апоптотическим процентным соотношением 31,30 % и 89,76 % соответственно. Процентное соотношение апоптотических клеток понижается при повышении концентраций Канглайта, например, менее чем 10% опухолевых клеток подверглись апоптозу в группе с концентрацией Канглайта 15 мкл/мл и 20 мкл/мл. Иммуногистохимический анализ показал, что меченый индекс экспрессии для гена Fas/Apo-1 составил 74,6 % в группе, леченой Канглайтом, и 21,2 % в контрольной группе. Индекс меченой экспрессии для гена Bcl-2 был 25 % в контрольной группе, тогда как в группе, получавшей 10 мкл/мл Канглайт, он составил 6,6 %.
Заключение:
        
механизм противоопухолевого действия Канглайта может быть обнаружен в его способности индуцировать апоптоз и некроз опухолевых клеток. Канглайт в концентрации <10 мкл/мл главным образом индуцирует апоптоз в опухолевых клетках. Оптимальная концентрация для индукции клеточного апоптоза – 10 мкл/мл. Концентрация больше, чем 10 мкл/мл вызывает некроз опухолевых клеток. Противоопухолевый эффект Канглайта можно объяснить его способностью повышать экспрессию гена Fas/Apo-1 и ингибировать экспрессию гена Bcl-2.
Ключевые слова: Канглайт, апоптоз, Fas/Apo>-1, Bcl-2.


          Канглайт для инъекций – противоопухолевый агент, изготовленный из семян Коикс, применяемых в традиционной китайской медицине. Фармакодинамические и клинические исследования показали, что Канглайт оказывает определенный терапевтический эффект, ингибируя рост многих опухолей. Но механизм его действия на клетки рака почки не был описан. Целью этого исследования было изучить противоопухолевый механизм действия Канглайта на клетках рака почки и использовать как руководство для клинической комбинированной терапии опухолей.

1.Материалы и методы

2.Препараты и клеточные культуры
          
Канглайт для инъекций (10 %) и эмульсия для контроля предоставлены Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co., Ltd. Голубой тетразолий [3(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н тетразолий бромид] (МТТ) был приобретен в Sigma, USA. Диметил сульфоксид (ДМСО) был приобретен в Англии, APO-DIRECT Kit был приобретен Mannheim, USA.
          Линия клеток гранулоцитарной почечной карциномы (GRC-1) была предоставлена институтом урологии первого госпиталя медицинского университета Пекина. Клетки культивировали и пересевали в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 15% телячью сыворотку при 37С, 5% СО2 в инкубаторе.
           Проточный цитометр: FACScan (Becton Dickinson, USA) предоставлен для анализа отделением первого госпиталя медицинского университета Пекина.
 3.МТТ-метод (восстановление голубого теразолия)
          
В каждую лунку 96-луночного плато водили 0,2 мл 1?105/мл опухолевых клеток в логарифмической фаза роста. Создавали контрольную группу с физиологическим раствором и экспериментальные группы с разными концентрациями Канглайта в 6 параллельных лунках каждой группы. Клетки культивировали в инкубаторе при 37 ?С, 5% СО2 в течение 72 ч. Добавляли 10 мл МТТ (5мг/мл) в каждую лунку за 4 ч до окончания эксперимента. Культуральную среду удаляли до теста. В каждую лунку добавляли 200 мл ДМСО. В каждой лунке измеряли поглощение (O.D. значение) с помощью фотометрии при длине волны 570 мн. Степень ингибирования клеточной пролиферации рассчитывали по формуле:
        Степень ингбирования (%) = (1 – значение O.D. в экспериментальной группе/значение O.D. в контрольной группе) ? 100 %.


         IC50 рассчитывали с логарифмической вероятностью графическим методом.


4.Исследование клеточного апоптоза иммунофлюоресцентным красящим методом TUNEL (меченая терминальная диоксинуклеотидил трансфераза)
           Использовали APO-DIRECT Kit. Клетки почечной карциномы культивировали обычным способом. 0 мкл/мл, 5 мкл/мл, 10 мкл/мл, 15 мкл/мл и 20 мкл/мл Канглайта для инъекций добавляли в каждую экспериментальную группу, пока формировался приблизительно один слой клеток. Эти клетки культивировали 48 ч, затем отстаивали. Дважды промывали с 1?106 клеточной суспензией и фосфатным буферным раствором (PBS), затем фиксировали в 5% параформальдегиде в течение 15 минут и снова промывали PBS. Добавляли 50 мл флюоресцентно-меченых TUNEL, перемешивали с красящим раствором до клеточной седиментации и держали на водяной бане при 37 ?С в течение 1 ч, промывали PBS и добавляли 20мкл йодистого пропидия (PI) при комнатной температуре в течение 30 минут для исследования.
5.Иммуногистохимический анализ
           
Опухолевые клетки в логарифмической фазе роста обрабатывали 10 мкл/мл Канглайта и 10 мкл/мл пустой эмульсией в течение 48 ч, затем настаивали. Делали мазки и держали во влажном боксе в течение 5 ч, дважды промывали PBS, затем фиксировали холодным ацетоном в течение 15 минут и окрашивали SP-методом. Кроме того, PBS и нормальная кроличья сыворотка использовались для пустого контроля (SP kit, Fas/Apo-1, Bcl-2 моноклональные антитела предоставлены Zhongshan Biotechnology Co.). Метод оценки интенсивности экспрессии генов: позитивная экспрессия гена Fas/Apo-1 была, когда на мембране проявился коричнево-желтый цвет, а позитивная экспрессия гена Bcl-2 была, когда в цитоплазме появился желтый цвет.
          Для наблюдения были отобраны 5 НР визуальных полей (100) и было рассчитано среднее число клеток. Меченый индекс (LI) гена Fas/Apo-1 в мембране и LI гена Bcl-2 в цитоплазме были соответственно рассчитаны по формуле:


            LI = (число позитивных клеток/общее число подсчитанных клеток) ? 100 %.

6.Статистический анализ SAS software применяли для Т-теста.
7.Результаты
8.Ингибирующее влияние Канглайта на клетки карциномы почки
          
После обработки клеток GRC-1 Канглайтом для инъекций, было обнаружено, что Канглайт влияет на ингибирование пролиферации клеток GRC-1 (IC50= 19,3 мкл/мл).
9.Исследование апоптоза клеток карциномы почки, вызванного Канглайтом
          
После обработки клеток GRC-1 Канглайтом для инъекций различных концентраций в течение 48 ч клеточный апоптоз, индуцированный Канглайтом, изучали методом TUNEL-проточного цитометрического сканирования. При обработке клеток GRC-1 Канглайтом в концентрации 5 мкл/мл и 10 мкл/мл, степень позитивных клеток в участке М1 была 31,30 % и 89,76 % соответственно, в то время как в контрольной группе она составила 1,02 %. При обработке клеток GRC-1 Канглайтом в концентрации 15 мкл/мл и 20 мкл/мл, процентное соотношение позитивных клеток в участке М1 было 1,76 % и 8 % соответственно, не было значительной разницы в сравнении с контрольной группой (см. рис. 3).
10.Влияние Канглайта на Fas/Apo-1 и Bcl-2
             Экспрессия гена Fas/Apo-1 в GRC-1 клеточной линии была слабой в группе, получавшей эмульсию, LI составил 21,20 %. Экспрессия гена Fas/Apo-1 в клеточной линии GRC-1 была значительно интенсивнее в группе, получавшей Канглайт, LI был 74,60 %.
             Экспрессия гена Bcl-2 была измерена в цитоплазме клеток почечной карциномы в контрольной группе, там LI составил 25 %. Экспрессия гена Bcl-2 в клетках GRC-1 снижалась в группе, получавшей Канглайт, при увеличении концентрации Канглайта. Экспрессия гена Bcl-2 достигла низшего уровня при обработке клеток Канглайтом в концентрации 10 мкл/мл, LI был 6,6 % (см. рис. 1 и 2). 11.Обсуждение
           
Почечная карцинома очень тяжело поддается лечению. Из-за высокой степени экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (примерно в 87 % случаев) результаты химиотерапии далеки от удовлетворительных. В настоящее время не существует идеального лечения для почечной карциномы.
              Апоптоз опухолевых клеток – независимый процесс клеточного самоуничтожения вследствие расщепления ДНК активированной эндонуклеазой, с формированием 50-300 kbp сегментов, а затем разбивки на меньшие сегменты (200 bp). Электрофорез проявляет «ДНКовую лестницу». Апоптоз также можно исследовать мечением флюоресцином изотиоцианатом (FITC-dUTP) одноцепочной или двухцепочной 3-гидроксил терминальной группы 200 bp сегментов с помощью терминальной деокснуклеотидил трансферазы (TdT). Количественный анализ апоптотических клеток можно провести в соответствии с интенсивностью флюоресценции. Отличие апоптоза от некроза также можно проверить этим методом, более чувствительным и специфичным, чем метод гель-электрофореза.
               Многие ученые описывали цитотоксическое действие Канглайта на различные опухоли in vivo и in virto. Исследования цикла клеточной пролиферации показали, что Канглайт замедляет рост опухоли путем блокирования клеток в G2+M фазе и снижая процент клеток в S фазе. Yang Hua et al. показали, что клетки человеческой эритролейкемии индуцируют апоптоз после обработки Канглайтом в течение 6 ч. При обработке клеток более высокой концентрацией Канглайта наблюдается повреждение клеточной мембраны и увеличивается некроз клеток. Апоптоз клеток человеческой карциномы толстой кишки SW1116, индуцированный Канглайтом, также определяется методом TUNEL. Исследования показали, что эффективная концентрация Канглайта, индуцирующая апоптоз опухолевых клеток, 10 мкл/мл.
               В нашем исследовании также наблюдали влияние Канглайта на ингибирование пролиферации клеток почечной карциномы после обработки Канглайтом. IC50 – 19,31 мкл/мл. Канглайт индуцировал апоптоз клеток почечной карциномы. Апоптотический процент был 31,30 % при обработке клеток 5 мкл/мл Канглайта, и 89,76 % при обработке 10 мкл/мл Канглайта. Количество апоптотических клеток снижалось при обработке клеток более высокими концентрациями Канглайта, показывая, что высокие концентрации Канглайта являются причиной некроза клеток. Мы полагаем, что существует оптимальная дозировка для противоопухолевого действия Канглайта; оптимальная терапевтическая концентрация Канглайта изучается для достижения наилучшей терапевтической эффективности.
              Ген Fas/Apo-1 играет важную роль в регуляции клеточного апоптоза в иммунной системе. Fas/Apo-1 – трансмембранный белок, принадлежащий к суперсемейству нервного фактора роста и рецептора TNF. Молекула Fas/Apo-1 – рецептор для передачи сигнала клеточного апоптоза. После комбинации с Fas/Apo-1-антителом или лигандом (Fas-лиганд, Fasl), продукция генов клеточного апоптоза активируется в цитоплазме, индуцируется апоптоз клеток и экспрессируются молекулы Fas/Apo-1. Хотя передача апоптотического сигнала Fas/Apo-1 в настоящее время точно не объяснена, научным сообществом допускается, что сигнал активирует Fas/Apo-1 и может индуцировать апоптоз в некоторых опухолевых клетках. Если сигнальная система Fas/Apo-1 повреждена, опухолевые клетки могут выборочно ускользать от иммунного надзора и приобретать некоторое преимущество в выживании. На поверхности активированных Т-лимфоцитов определяется высокая экспрессия белка Fas/Apo-1. Для индукции апоптоза на клеточной мембране должна быть достаточно высокая экспрессия Fas/Apo-1.          Структура всех звеньев системы передачи сигнала для экспрессии антигена Fas/Apo-1 может быть интактной. Молекулы Fas/Apo-1 широко экспрессируются в нормальных и в опухолевых клетках. Уровень экспрессии молекул Fas/Apo-1 в опухолевых клетках – важный показатель для диагностик и лечения рака. Li Hongjun et al. обнаружили высокий уровень экспрессии Fas/Apo-1 в клеточной линии карциномы мочевого пузыря (Т24) и в клеточной линии карциномы простаты (РС-3М). С другой стороны, в клеточной линии карциномы мочевого пузыря (BIU-87) и клеточной линии карциномы почки (RCC-949 и GRC-1) уровень экспрессии Fas/Apo-1 низкий, или вообще нет эксперссии.


           Наше исследование также показало, что уровень экспрессии молекул Fas/Apo-1 в GRC-1 клетках низкий, поэтому опухолевые клетки могут избегать надзора со стороны Т-лимфоцитов. Это может объяснить отсутствие клинического эффекта при иммунотерапии с использованием ИЛ-2 и интерферона при почечной карциноме. Мы обнаружили, что уровень молекул Fas/Apo-1 в клетках GRC-1 значительно увеличивается после обработки клеток 10 мкл/мл Канглайта в течение 48 ч. Предполагается, что увеличенная экспрессия гена Fas/Apo-1 в GRC-1 клетках сделает более легкой активацию Т-лимфоцитов для распознавания опухолевых клеток.
            Bcl-2 – протоонкоген со специфическим действием на ингибирование клеточного апоптоза, играющий важную роль в апоптотическом процессе. Противоопухолевая активность многих химиотерапевтических агентов, таких как Адриамицин и Цисплатин, происходит из-за их способности понижать уровень экспрессии Bcl-2. Многие исследователи полагают, что разная чувствительность лейкозных клеток к химиотерапевтическим агентам соотносится с уровнем экспрессии Bcl-2. В процессе лечения миеломы ИЛ-6, Г-КСФ, глюкокортикоиды и дексаметазон подавляется экспрессия гена Bcl-2 и чувствительность к Адриамицину и Цитарабину возрастает и индуцируется апоптоз клеток лейкемии. В этом исследовании показано, что 10 мкл/мл Канглайта оказывают влияние на ингибирование клетками GRC-1 экспрессии гена Bcl-2. Многие исследователи обнаружили влияние Канглайта на увеличение чувствительности к химиотерапии и радиотерапии в лечении опухолей. Можно предположить, что механизм, лежащий в основе повышения убивающего клетки действия химиотерапии или радиотерапии в комбинации с Канглайтом, может быть связан с ингибированием гена Bcl-2 в опухолевых клетках.

Список литературы

  1. Arends M.J., Morris R.G. and Wyllie A.H. Apoptosis: The Role of Endonuclease. AM J Pathol 1990; 136: 593.
  2. Dolzhanzkiy A, Basch R.S. Flow Cytometric Determination of Apoptosis in Heterogenous Cells. J Immuno Methods 1995; 180: 131.
  3. Yang Hua, Wang Xianping, Yu Linlin et al. The Effects of Kanglaite Injection on Cancer Cell Proliferation Cycle. Report of Clinical Application 3, 1996.
  4. Yang Hua, Wang Xianping, Yu Linlin et al. A Study of  Kanglaite Injection treated Human Erythroleukemia K562 Cells with TUNEL and Annexin V Labeling Technique-Flow Cytometric Scan Methods, Report of Clinical Application 4, 1997.
  5. Evans DL, Dive C. Effects of Cisplatin on the Induction of Apoptosis in Proliferating Hepatoma Cells and Nonproliferating Immature Thymocytes. Cancer Res 1993; 53:2133.
  6. Zhang Xiaodong, Wang Wenliang. The Set-up of the Model of Aoptosis Induced by Adriamycin in Human Hepatic Carcinoma. Chinese Journal of Oncology 1997; 19:260.
  7. Wang Junjie, Shen Wenjiang, Yu Lizhang. The effects of Kanglaite Injection on Radiosusceptibility of Renal Carcimona Cells. To be published.

Рисунок 1. Апоптоз клеток GRC-1, индуцированный разными концентрациями Канглайта:
А – негативный контроль; Б – позитивный коньроль; В – эмульсия; Г – 5 мкл/мл Канглайта; Д – 10 мкл /мл Канглайта; Е – 15 мкл /мл Канглайта; Ж – 20 мкл /мл Канглайта.